collagen是什么意思lagen的用法读音典

第37卷第4期四川大学学报(工程科学版)

Vol.37No.4

2005年7月JOURNALOFSICHUANUNIVERSITY

(

ENGINEERI小学生清明节绘画图片 NGSCIENCEEDITION

)

July2005

文章编号:100923087

(

2005

)

胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异

李国英,张忠楷,雷 苏,石 碧

3

(四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都610065

)

摘 要:由于胶原、明胶和水解胶原蛋白制备工艺的差异,造成它们在结构和性能上存在较大的差别。用十二烷基

硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(

SDS-PAGE

)方法确定3种样品的相对分子质量及其分布。结果表明:胶原的相对

分子质量大约为30万,分布很窄;明胶的相对分子质量从几千到10万,分布很宽;水解胶原蛋白相对分子质量从几

千到3万,分布也很宽。3种样品中只有胶原和明胶能够成膜,但是胶原膜的抗张强度(

58N/mm2)大于明胶膜(

36

N/mm2)

,并且只有胶原膜在扫描电子显微镜(

SEM

)下呈现出纤维结构。纤维成形实验表明只有胶原才具有成纤维

能力。角质形成细胞培养实验证明了只有胶原有利于细胞的吸附和生长,明胶和水解胶原蛋白与培养皿培养的参

比样相似,都对细胞的吸附和生长无明显的促进作用。由此得出结论:只有胶原才有生物活性,具有比明胶和水解

胶原蛋白更大的潜在生物医学用途。

关键词:胶原;明胶;水解胶原蛋白

中图分类号:TS59文献标识码:A

DifferencesinPropertiesofCollagen,GelatinandCollagenHydrolysate

LIGuo2ying,ZHANGZhong2kai,LEISu,SHIBi

3

(

nUniv.,Chengdu610065,China

)

Abstract:Therearemanydifferencesinstructuresandpropertiesamongcollagen,gelatinandcollagenhydrolysatebe2

ecularweightanddistributionofsamplesweredeterminedbysodiumdo2

decylsulphate2polyacrylamidegelelectrophoresis

(

SDS-PAGE

)

.Theresultsshowedthatthemolecularweightofcolla2

genisabout300,000daltonsandnarrowdistribution,whichisgreaterthanthoseofgelatin

(

fromseveralthousandsto

100,000Daltonsandwidedistribution

)

andcollagenhydrolysate

(

fromseveralthousandsto30,000Daltonsandwide

distribution

)

.Fibrilformationetion,col2

lagenmembrane

(

58N/mm2)

hashigherextensionstrengththangelatinmembrane

(

36N/mm2)

andpresentedremarkable

fibrilshapeasobservedbyscanningelectronmicroscope

(

SEM

)

,andcollagenhydrolysatecouldnotformmembrane.

Furthermore,keratinocytecultureexperimentprovedthatonlycollagenhassignificanteffectsoncellattachmentandpro2

liferation,andcellsculturedongelatinandcollagenhydrolysateshowedsimilarpropertiestothoseofcellsculturedon

econcludedthatcollagenwithitsbiologicalactivityhasgreaterpotentialtobeusedasbiologicalmaterial

comparedtogelatinorcollagenhydrolysate.

Keywords:collagen;gelatin;collagenhydrolysate

收稿日期:2005-03-10

基金项目:高等学校优秀青年教师教学科研奖励基金资助项目(

2001-2005

)

;四川大学归国留学人员科研启动基金资助项目(

2004-2005

)

作者简介:李国英(

1967-

)

,女,教授.研究方向:动物生物质利用.

3通讯联系人

胶原是构成动物机体的重要功能物质,遍布动

物内的各处器官,并对各器官的正常生理功能的调

节起着举足轻重的作用。胶原具有其他合成材料无

法比拟的生物相容性、可生物降解性以及生物活性,

比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成

活与生长、促进血小板凝结等。胶原经特殊处理后,

可用于烧伤和创伤治疗、美容、矫形、组织修复、创面

止血等医药卫生领域。现已运用于临床中的有用于

烧伤创伤治疗的胶原膜,用于美容矫形的胶原医用

注射剂,用于创伤止血的胶原止血海绵等。胶原作

为一种皮肤结构蛋白质,在护肤品中起着滋润、调理

和保湿等作用。因此,胶原作为天然的生物资源,可

以广泛应用于食品、医药、组织工程、化妆品等领

域[1]。

明胶是胶原在高温作用下的变性产物,在食品、

医药卫生等方面也有重要的应用价值[2]。明胶是一

种营养价值较高的低卡保健食品,在食品中的应用

有:糖果添加剂,使糖果更富弹性、韧性和透明性;冷

冻食品添加剂,比如胶冻剂、稳定剂等;肉制品改良

剂,比如作为胶冻剂添加到肉制品中,可以提高产品

的质量;此外,还可用作乳制品添加剂,食品涂层材

料及蛋糕制作。明胶在医药卫生方面主要用于制作

药物胶囊。

水解胶原蛋白是胶原的水解产物,具有更小的

相对分子质量,并且更易降解,所以在营养保健摊破浣溪沙南唐李璟 品和

日用化学品开发方面拥有一定的市场。水解胶原蛋

白可用于生物发酵培养基,也可以作为一种高蛋白

饲料营养添加剂替代进口鱼粉用于混、配合饲料生

产。

胶原、明胶和水解胶原蛋白这3种物质虽具有

同源性,但在结构和性能上却有很大的区别。胶原

保留特有的天然螺旋结构,在某些方面表现出明显

优于明胶和水解胶原蛋白的性能,如胶原止血海绵

止血性能优于明胶海绵[3],作为澄清剂用的鱼胶原

如果变性则沉降能力明显降低[4]。然而,目前人们

对这3种物质的认识常常产生混淆,认为它们具有

相同性质,甚至认为它们是同一种物质。作者选用

胶原、明胶和水解胶原蛋白来源于牛皮I型胶原,从

它们性能差异着手,用实验说明它们之间的区别以

指导各自的开发利用。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

所用试剂均为分析纯。胃蛋白酶1∶10000昨夜西风凋碧树的意思 、三羟

甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、MCDB153和

KGM-2细胞培养液,胰酶1∶250;B型明胶,华美生

物工程公司;牛血清白蛋白,北京元亨圣马生物技术

研究所;L-羟脯氨酸、考马斯亮蓝R250,上海伯奥

生物科技公司;对二甲氨基苯甲醛,天津傲然精细化

工研究所;氯氨T,成都科龙化工试剂厂。

水浴振荡器HZS-H,哈尔滨市东联电子技术

开发有限公司;高速冷冻离心机GL-20G-Ⅱ,上海

安亭科学仪器厂;电泳仪Mini-PROTEAN3CellAs2

sembly,美国BIO-RAD公司;恒温水浴锅B-260,

上海亚荣生化仪器厂;紫外可见分光光度计

UV751GD,上海分析仪器总厂;扫描电子显微镜JSM

-5900LV,日本JEOL公司;显微镜IMT-2,日本

OLYMPUS公司。

1.2 胶原的制备

新鲜牛皮,脱脂、脱毛后充分水洗,再切成碎块

匀浆。称取20g匀浆后的物料,在4℃用适量的胃

蛋白酶作用24h。以10,000r/min速度离心30min

得到上清液,经盐析、透析处理后,冷藏备用。用

Bergman和Loxley方法测定羟脯氨酸含量,确定胶原

的浓度[5]。

1.3 水解胶原明月别枝惊鹊图片 蛋白的制备

称20g明胶溶于去离子水,用适量胰蛋白酶在

42℃水解明胶液得到水解胶原蛋白。用Biuret方法

测定水解胶原蛋白的浓度[6]。

1.4 电泳(

SDS-PAGE

)分析

先配制相同浓度的胶原、明胶和水解胶原蛋白

溶液,与样品处理液(将SDS、甘油、BPB、

-巯基乙

醇溶于Tris-HCl缓冲液中)混合,在沸水中加热5

min,冷却备用。用7.5%丙烯酰胺凝胶对胶原、明

胶以及水解胶原蛋白进行电泳分析。采用考马斯亮

蓝R250染色,7.5%醋酸和5%甲醇溶液脱色。

1.5 成膜及其性能表征

分别将10ml浓度为5mg/ml的胶原、明胶和水

解胶原蛋白溶液倒入培养皿中,在室温下干燥、成

膜。用扫描电子显微镜观察膜的形貌特征,并测定

膜的抗张强度和断裂伸长率。

1.6 再纤维试验

取胶原、明胶和水解胶原蛋白溶液各10ml,浓

度均为0.5mg/ml,装入透析袋中,用缓冲液(

0.1

mol/LNa

2

HPO

4

,0.05mol/L柠檬酸,pH=7.2

)透析

后于313nm处观察其吸光度随时间变化情况,得到

它们的纤维形成曲线[7]。用扫描电子显微镜观察形

成的纤维的形貌特征。

55第4期李国英,等:胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异

1.7 角质诗经采薇原文及翻译赏析 形成细胞的分离和培养

取新出生的小白鼠皮肤,用胰蛋白酶处理2h,

剥取表皮层,粉碎匀浆,反复用含有微量牛胎盘白蛋

白的MCDB153培养液冲洗,然后用40

m细胞过滤

器过滤,经离心后收集角质形成细胞。在37℃、5%

CO

2

培养箱环境中,将提取的角质形成细胞在KGM

-2介质培养液中培养。大约3～4d后,细胞繁殖

成锥形,可用于研究其在不同样品膜上的吸附和繁

殖情况。

1.8 细胞吸附和生长

在室温下,分别在35ml培养皿上涂上相同浓

度的胶原、明胶和水解胶原蛋白,2h后在培养皿中

加入细胞密度为4104/cm2的角质形成细胞,培养

10h后,用显微镜观察细胞的生长情况。

2 结果与讨论

2.1 相对分子质量的对比

从图1所示的电泳分析图谱可以看出:胶原的

相对分子质量最大,胶原的电泳图有3条泳带,在

100kD附近出现的2条泳带分别是胶原分子的

1

链和

2

链,在200kD附近出现的1条泳带是胶原分

子的

链。即胶原的每条多肽链相对分子质量为10

万,3条多肽链构成一个胶原分子,1个胶原分子相

对分子质量为30万;明胶的电泳分离带为一个连续

带,相对分子质量主要分布在几万到10万;水解胶

原蛋白也是一个连续分离带,但其相对分子质量比

明胶小,主要分布在几千到3万。

a:标准相对分子质量;b:胶原;c:明胶;d:水解胶原蛋白

图1 胶原、明胶和水解胶原蛋白的电泳分析

Fig.1 SDS-PAGEanalysis(7.5%)ofcollagen,gelatin

-PAGEmolecular

weightstandards,collagen,gelatin,collagenhy2

drolysate

导致胶原、明胶和水解胶原蛋白三者之间相对

分子质量差异的主要原因是制备工艺的不同。在实

验制备过程中,胶原是在低温下用胃蛋白酶提取的,

该酶仅作用胶原的端肽,不作用于胶原分子的3股

螺旋结构部分,即胶原未发生变性。由于胶原的3

条分子链形成的3股螺旋结构完整保留,因此胶原

的相对分子质量最大,一个胶原分子的相对分子质

量约为30万。明胶是胶原纤维经高温作用后的产

物,其组成复杂,相对分子质量分布宽,由于高温造

成胶原蛋白变性,胶原分子的3股螺旋结构被破坏,

但可能有部分

链的螺旋链还存在,因此一定浓度

的明胶溶液能成凝胶状。水解胶原蛋白是在较高温

度下用蛋白酶水解胶原或明胶得到的,受温度和酶

的双重作用,使水解胶原蛋白的相对分子质量比明

胶更小。由于在较高温度条件下,蛋白酶对胶原肽

键的水解是随机的,使水解得到的蛋白液组成也很

复杂,是相对分子质量从几千到几万的蛋白多肽的

混合物。

2.2 成膜性能对比

实验发现:水解胶原蛋白不能成膜,而胶原和明

胶可以成膜。用扫描电子显微镜观察到的胶原膜和

明胶膜的微观结构,如图2所示。

(

a

)胶原膜

(

b

)明胶膜

图2 胶原膜和明胶膜的表面形貌

Fig.2 Surfacemorphologiesofcollagenmembrane

andgelatinmembrane

从图2

(

a

)可以看出,胶原成膜后仍保持网状纤

维结构,而图2

(

b

)显示出明胶膜已不具有纤维结构

65四川大学学报(工程科学版)第37卷

特征,电子显微镜观唯见长江天际流意思 察到的只是一个平滑表面。此

外,实验中发现明胶膜性脆、无韧性,易破碎;而胶原

膜具有一定的柔韧性、延伸性,强度较好。实验测得

明胶膜和胶原膜的抗张强度分别为(

364

)

N/mm2,

(

585

)

N/mm2,断裂伸长率分别为(

3.00.5

)

%和

(

7.00.5

)

%。

由于胶原、明胶和水解胶原蛋白的相对分子质

量和结构差异,造成它们具有不同的成膜能力。胶

原相对分子质量最大且保持三股螺旋结构,因而它

的成膜能力最强,并且膜的机械性能最好。明胶虽

还具有成膜能力,但由于丧失了胶原分子的螺旋构

象,膜的机械性能不如胶原膜。而水解胶原蛋白则

完全丧失成膜能力。

2.3 再纤维性的对比

将胶原、明胶和水解胶原蛋白在模拟生理条件

(与动物体内相似的温度和中性盐含量)下放置25

min,期间不断观察其吸光度的变化,得到它们的纤

维形成曲线,如图3所示。

图3 胶原、明胶和水解胶原蛋白的纤维形成性能

Fig.3 Fibrilformationpropertiesofcollaren,relation,

andcollagenhydrolysate

从图3可以看出,在实验条件下胶原溶液吸光

度在短时间内即快速增大,然后到达一个相对稳定

的平台。而明胶和水解胶原蛋白在实验的整个过程

中吸光度都基本保持不变。这是票字组词 由于胶原溶液在生

理条件下,胶原分子之间能再度相互连接形成纤维,

导致吸光度上升。由此说明:只有胶原溶液具有独

特的再纤维性质,而它的变性产物明胶和降解产物

水解胶原蛋白则不具有这样的性质。

用扫描电子显微镜观察胶原按照以上条件形成

的胶原纤维的结构,如图4所示。图4表明,胶原的

再纤维呈多孔网状结构。这是因为胶原溶液中的胶

原分子仍然保留其三股螺旋结构,所以在适当的条

件下,溶液中的胶原分子靠氢键或分子间作用力连

接,再度以四分之一交错排列的方式形成纤维束。

而明胶和水解胶原蛋白的三股螺旋结构都被破坏,

而且这种破坏是不可逆的,因而丧失了再纤维性。

所以,胶原、明胶和水解胶原蛋白中,只有胶原才具

有再纤维的生物活性。这也决定了它们在应用上的

不同。

图4 胶原再纤维的扫描电子显微镜图

Fig.4 SEMimageofcollagen2reconstructedfibril

2.4 细胞生物学性能对比

胶原和明胶以及水解胶原蛋白对细胞生长的影

响也存在很大的区别[8～9]。采用角质形成细胞分别

在胶原、明胶和水解胶原蛋白底物上进行细胞培养

时,培养10h后用显微镜观察到的细胞生长繁殖情

况如图5、图6所示。

(

a

)胶原

(

b

)明胶

图5 角质形成细胞在胶原和明胶的培养图片

Fig.5 Photomicrographsofkeratinocytescultruredoncol2

lagenandgelatin

75第4期李国英,等:胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异

(

a

)水解胶原蛋白

(

b

)培养皿

图6 角质形成细胞在水解胶原蛋白和培养皿上的培养

图片

Fig.6 Photomicrographsofkeratinocytescultruredoncol2

lagenhydrolysateandculturedish

图5,图6的结果证明,胶原上培养的细胞的生

长繁殖能力明显优于在明胶和水解胶原蛋白上的培

养效果,实际上明胶和水解胶原蛋白对细胞的生长

繁殖作用与空白样相差不大。因此可以认为明胶和

胶原水解蛋白丧失了胶原的天然结构,已不具有生

物活性。

3 结 论

胶原属于结构蛋白质,在体内以胶原纤维的形

式存在。在低温下提取得到的胶原,仍然保持三股

螺旋结构,相对分子质量为30万,形成的膜具有较

好的柔韧性、弹性和强度,在模拟生理条件下能再形

成纤维,能明显激活细胞的生长。明胶的三股螺旋

结构已被破坏,相对分子质量分布较宽,从几万到

10万;明胶能成冻、成膜,但明胶膜性脆、强度比胶

原膜差。水解胶原蛋白是多肽混合物,相对分子质

量为几千到几万,相对分子质量分布很宽;水解胶原

蛋白不能成膜。明胶和水解胶原蛋白均不能再度形

成纤维,而且细胞生长实验证明,它们不具有促进细

胞生长的性质,即明胶和水解胶原蛋白不具有生物

活性。

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(编辑 黄小川)

85四川大学学报(工程科学版)第37卷