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2023年4月20日发(作者：鹤立鸡群是什么意思)锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析

周井祥;李新伟;王好;吕文亮;朱霞

【摘要】To study its structure and function, the ORF81 gene was amplified
by PCR from koi herpes virus China\'s Jilin strains (KHV-CJ) infected. Mirror
carp primary fin cells were then海上升明月天涯共此时全诗 cloned into the vector pMD18-T to
construct the recombinant plasmid. The structure and function of the gene
were studied by means of bioinformatics software, including phylogenetic
tree analysis compared with other three KHV strains published in GenBank.
The results showed that the length of the 0RF81 gene,encoding 256 aa,was
771 bp. The molecular weight was 28 246. 50 u and the isoelectric point
was 8. 404. The protein is hydrophobic. The most likely signal peptide cut
was in 29 bit( Ser). ORF81 has four transmembrane regions. The
antigenicity of ORF81 was good. According to the protein structure
analysis, there may be no N-glycosylation sites,6 O-glycosylation sites and
11 phosphorylation sites. Phylogenetic analysis showed that he ORF81
gene of KHV-CJ was in the same branch with the Israel strain. Above all,
ORF81 gene may have good immunogenicity. The study established the
foundation for genetic background information, pathogenesis, molecular
epidemiology and genetic engineering vaccine research of koi herpes
virus.%为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-孟浩然的古诗100首 CJ) ORF81蛋白的结构特征和进化
关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81
基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒.应用生物信息学方法初步分析
KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统

进化树.结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸；预测
ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404；疏水性大于亲水性；
信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸)；有4个跨膜区；抗原表位预测显
示抗原性良好；结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和
11个磷酸化位点；系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支.

【期刊名称】《水产学报》

【年(卷),期】2011(035)012

【总页数】7页(P1780-1786)

【关键词】锦鲤疱疹病毒;ORF81基因;克隆测序;生物信息学分析

【作者】周井祥;李新伟;王好;吕文亮;朱霞

【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,动物生产及产品质量安全教育部重点实
验室,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,动物生产及产品质量安全教育
部重点实验室,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,动物生产及产品质量
安全教育部重点实验室,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,动物生产及
产品质量安全教育部重点实验室,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,动
物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林长春130118

【正文语种】中文

【中图分类】S917;Q785

锦鲤疱疹病毒病(koi herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(koi
herpesvirus,KHV)感染锦鲤(Cyprinus carpio koi)、鲤(Cyprinus carpio carpio)

及其普通变种如框镜鲤等而导致的一种具有高度传染性和致死性的疾病。1998年
KHV首次在以色列的Magan Michael地区和美国暴发[1],2000年传至英国、德
国和比利时[2];2002年4月,印度尼西亚发生此病,同年中国广东省和台湾省的锦鲤
疑似发生此病[3-4];2003年10月日本证实该病已在本国存在[5]。目前,该病在我
国的鲤养殖中频繁发生,造成鲤的大量死亡,给鲤养殖业带来了严重危害。2007年
国家质检总局发布警示预报,要求将KHV作为必检项目,并加强对其他国家进口的
锦鲤和鲤的检测。
KHV是双股线形DNA病毒,是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[6]。目
前,GenBank已经公布了3株分别来自日本、美国和以色列锦鲤疱疹病毒的基因序
列[7],基因组大小为295 kb,并含有22 kb的末端同向重复序列;有156个开放性阅
读框(ORF),8个末端重复序列。KHV的156个ORF的功能只有少数已经确定其功
能。ORF25和ORF99编码膜糖蛋白;ORF81和ORF83编码主要囊膜蛋白,主要在
细胞质中合成[8]。
研究发现,ORF81在大量表达时出现细胞核缩小,细胞从瓶壁脱落的现象。
ROSENKRANZ等[9]对ORF81重组研究表明,其重组体蛋白的表达可作为免疫荧
光试验和ELISA检测KHV特异性血清抗体的诊断性抗原,还可以用于抗KHV的亚
单位或DNA疫苗的研究。ORF72和ORF92编码衣壳蛋白,邱芮瑜[10]研究表
明,KHV的ORF72和ORF92可分别表达47.6 ku和145 ku的蛋白,且二者表达量
较大,可用于KHV的快速检测。
目前国内尚无有效控制KHV的方法。本研究以本实验室在国内首次分离到的锦鲤
疱疹病毒吉林株(KHV-CJ)基因组为模板,成功克隆到KHV主要囊膜蛋白基因——
ORF81基因,并名言名句励志经典语录分析其生物学信息,旨在为锦鲤疱疹病毒的基因背景信息、发病机理、
分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础。
1 材料与方法

1.1 细胞与病毒
锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)、锦鲤疱疹病毒尾鳍原代细胞由吉林农业大学
动物生产及产品质量安全教育部重点实验室分离保存或提供[11]。
1.2 菌株与载体
pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司, DH5购自北京全式金生物技
术有限公司。
1.3 主要试剂
新生牛血清、Gibco M199培养基为Invitrogen公司产品;ExTaq DNA聚合酶、
限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ、DNA Marker等购自大连宝生物工程有限公司;凝
胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化有限公司。
1.4 引物的设计与合成
根据GenBank上登录的锦鲤疱疹病毒ORF81基因序列,利用Primer Premiers
5.0软件设计1对引物,上游引物:P1 5′-CCCGGGATGGCAGTCACCAAAGCT-3′,
下游引物:P2 5′-TCTAGATCACCACATCTTGCCGG-3′,分别引入SmaⅠ和XbaⅠ
限制性酶切位点(划线部位),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的PCR扩增
按照HASEGAWA等[12]和 NEUKIRCH等[13]的方法培养细胞。将KHV-CJ病毒
液接种框镜鲤尾鳍原代细胞单层,逐日观察细胞病变情况,收集细胞病变达70%～80%
的细胞及上清液,收集病毒后常规方法提取病毒DNA,采用25 L反应体系进行
PCR扩增,反应条件如下:95 ℃预变性5 min,94 ℃ 40 s,59.3 ℃ 30 s,72 ℃ 1
min,35个循环。
1.6 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的克隆及鉴定
将目的片段纯化回收后,与pMD18-T载体连接,转化至DH5感受态细胞,氨苄青
霉素筛选单菌落,提取重组质粒后以SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定阳性重组质粒,命名

为pMD18-T-81,送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.7 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因编码蛋白的生物信息学分析
利用DNAStar软件翻译出ORF81基因的核苷酸序列;利用
SingalPv3.0(http:∥/services/SignalP/)软件进行氨基酸序列的
信号肽分析;利用TMHMM Server
v.2.0(http:∥/services/TMHMM/)软件进行跨膜区分析;利用
ProtScale(http:∥/tools/)软件分析蛋白的疏水性;
利用BepiPred 1.0 Server(http:∥/services/BepiPred/)软件和
DNAStar 6.0(Protean)对ORF81序列编码的蛋白进行抗原表位分析;分别利用
NetNGlyc1.0(http:∥/services/NetNGlyc/)和
YinOYang1.2(http:∥/services/YinOYang/)在线分析软件进行
N-糖基化位点和O-糖基化位点预测,利用NetPhos
2.0(http:∥/services/NetPhos/)进行磷酸化位点预测。
1.8 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的系统进化树分析
从GenBank上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株、美国株和以色列株的基因序列,利
用DNAStar 6.0(MegAligen)构建不同锦鲤疱疹病毒株的ORF81基因进化树,分析
其进化关系。
2 结果
2.1 框镜鲤尾鳍原代细胞(MFC)接种KHV后细胞病变
MFC接种KHV后,5～6 d出现细胞体积增大及少量的细胞空泡化,10 d后病变更
加明显,且细胞开始从瓶壁脱落。
图1 KHV在MFC产生的细胞病变Fig.1 Cytopathic effect induced by KHV
2.2 ORF81基因的PCR扩增和鉴定
PCR扩增出一条与目的片段大小相符的DNA片段(图2),pMD18-T-81用SmaⅠ

和XbaⅠ进行双酶切,获得一段约771 bp的片段(图3),说明ORF81基因片段已成
功克隆至载体中。
2.3 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的生物信息学分析
基因的序列测定和编码蛋白质分子特征测序结果表明,ORF81基因长771 bp,为一
完整的开放阅读框,编码256个氨基酸,预测ORF81的理论分子量为28 246.50 u,
等电点为8.404,含有25个强碱性氨基酸(K、R)、21个强酸性氨基酸(D、E)、105
个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、63个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。
信号肽分析将测得的ORF81氨基酸序列在丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)
的网站http:∥/services/SignalP进行在线分析,通过
SingalPv3.0进行信号肽切割位点的预测。使用Neural net-work(NN)和Hidden
Markov(HMM)两种模型进行预测,前者能够对信号肽的分泌途径以及切割位点进
行预测,预测值标示为Smean;后者主要是对该氨基酸序列是否具有信号肽进行分析
和预测,同时也对信号肽切割位点及分布进行预测,预测值表示为S啪组词拼音 prob。结果显示
(图4),NN和 HMM显示信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸)。
图2 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的PCR扩增M:DNA 分子量
标准; 1,2:PCR产物。Fig.2 PCR amplification of koi herpesvirus China Jilin
strain ORF81 geneM:DL2000DNA Markers; 1,2:product of PCR.
图3梅雪争春未肯降全诗的意思锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的双酶切鉴定M:DNA 分子量
标准; 1:pMD18-T-81的双酶切产物。Fig.3 The identification of koi
herpesvirus China Jilin strain ORF81 gene using double restriction enzymes
digestionM:8000DNA Markers;1:product from pMD18-T-81 digested by
SmaⅠ and XbaⅠ
跨膜区分析 TMHMM预测ORF81分别在44～66位、81～103位、120～142
位、162～184位有4个跨膜区(图5),其中N末端和C末端都位于病毒膜内区。

疏水性分析通过ProtScale在线分析表明,该蛋白具有一定疏水性,提示该蛋白高
疏水性白首不相离的上一句是什么区与膜蛋白跨膜区有明显相关性(图6)。
图4 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81的信号肽预测(a) SignalP-NN预
测(euk在线分析):序列; (b) SignalP-HHM预测(euk在线分析):序列。Fig.4 The
prediction of signal peptide of koi herpesvirus China Jilin strain ORF81
gene(a) SignalP-NN prediction(euk networks):sequence; (b) SignalP-HHM
prediction(euk networks):sequence.
图5 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81的跨膜区分析序列的TMHMM预
测后概率。Fig.5 Transmembrane domain analysis of koi herpesvirus China
Jilin strain ORF81 geneTMHMM postyerior probabilities for sequence.
抗原表位分析用http:∥/services/BepiPred/在线软件及
DNAStar 6.0(Protean)对锦鲤疱疹病毒ORF81基因编码的蛋白进行抗原表位分析,
得出其抗原表位主要集中在第7～14、21～28、68～77、105～111、184～212、
218～239和245～254位氨基酸(图7),表明该蛋白的表面抗原决定簇主要位于这
些区域,预示这些抗原表位可能与该病毒的致病性有关。
图6 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的疏水性分析序列的
Protscale分析输出信息。Fig.6 Hydrophobicity analysis of koi herpesvirus
China Jilin strain ORF81 geneProtscale output for user sequence.
图7 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的抗原表位分析Fig.7 The
prediction of the antigenic determinants of koi herpesvirus绝句杜甫拼音版本 China Jilin
strain ORF81 gene
糖基化及磷酸化位点的预测分别通过NetNGlyc1.0在线分析软件和
YinOYang1.2在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81进行N-
糖基化位点和O-糖基化位点预测。结果表明,其氨基酸序列不存在潜在的N-糖基

化位点;分别在4、148、157、252位存在4个潜在的O-糖基化位点。用
NetPhos 2.0在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81进行磷酸
化位点进行预测,结果显示,当阈值取0.5时,其氨基酸存在11个潜在的磷酸化位点
(包括4个Ser-丝氨酸、1个Thr-苏氨酸和6个Tyr-酪氨酸位点)。
2.4 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的系统进化树分析
从GenBank上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株(KHV-J)、美国株(KHV-U)和以色列
株(KHV-I)的ORF81基因,和中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因构建了系统进化树
(图8),结果显示,KHV-CJ与KHV-I处于一个分支。
图8 锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因的系统进化树Fig.8
Phylogenetic tree of 重阳节祝福老人的祝福语 koi herpesvirus China Jilin strain ORF81 gene
3 讨论
锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的锦鲤和鲤的一种高致病性疾病。该
病多发生在水温为18～28 ℃的春秋季节,具有高度传染性,发病率和死亡率均可高
达80%～100%[8]。目前,锦鲤疱疹病毒病已在多国爆发,造成了巨大的经济损失。
防治病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫,目前,该病较为有效的疫苗是减毒疫苗,免
疫锦鲤和鲤,免疫保护率可达80%以上[14],但是弱毒苗存在散播病毒和病毒变异的
可能,而且在国内还没有研制出有效的弱毒疫苗。因此,需要进一步研究安全有效的
基因工程疫苗,避免病毒的散播并消除病毒变异的可能性,并填补目前国内没有有效
疫苗的空白,控制KHV在我国暴发流行。而本研究选用KHV-CJ ORF81基因进行
克隆和生物信息学分析,正是为基因工程疫苗的研制打下基础。
本实验成功获得了长771 bp的ORF81基因。生物信息学分析表明,其编码的蛋白
具有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;使用Neural net-work(NN)和
Hidden2022年虎年祝福语 Markov(HMM)两种模型对其信号肽进行预测,显示信号肽切割部位最可
能位于29位的S(丝氨酸)氨基酸。信号肽是引导翻译出的前体蛋白通过细胞膜分

泌到胞外的一段序列,只有切除信号肽序列后前体蛋白才能进入到分泌信号区,变成
具有正常功能的成熟蛋白[15],因此预测信号肽切割位点,可以对进行表达研究的引
物设计和表达载体的构建提供有价值的信息,另外,含有信号肽的蛋白质一般都是分
泌到细胞外,可能作为重要的细胞因子起作用,从而具有潜在的应用价值;通过分析软
件分析表明,其氨基酸序列不存在潜在的N-糖基化位点,具有4个潜在的O-糖基化
位点,糖基化是真核生物蛋白质翻译前或翻译后的一个重要修饰过程,并可提高蛋白
基因组的多样性[16],其中N-糖基化作用位点与抗原性和免疫原性有关[17]。
系统进化树分析表明,锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81基因与以色列株的
进化关系最近,同源性为100%,所以可怀疑KHV是由以色列等欧美国家传播至我国,
这为KHV有效疫苗的引进,以及研究资料的参考提供了依据。
本研究以在我国首次分离到的锦鲤疱疹病毒中国吉林株的DNA作为模板,成功将
其ORF81基因克隆,并采用生物信息学方法对ORF81的结构和功能进行了分析,为
我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息,发病机理,分子流行病学及基因工程疫苗爱国诗歌小学生的研究
奠定了基础。
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