tilling是什么意思ling在线翻译读音例句

分子植物育种，2004年，

第

2卷，

第

4期，

第

574-580页

MolecularPlantBreeding,2004,Vol.2,No.4,574-580

实验方法

EXPERIMENTALTECHNIQUE

TILLING技术的原理与方法述评

吴海滨1,2朱汝财2赵德刚1*

1贵州省农业生物工程重点实验室，

贵州大学，

贵阳，

550025

2

海南省农作物分子育种重点实验室，

三亚，

572025

*

通讯作者，degangzhao@

摘要

TILLING，

即

TargetingInducedLocalLesionsINGenomes（定向诱导基因组局部突变技术）

，是由美国

FredHutchinson癌症研究中心StevenHenikoff领导的研究小组发展起来的，

是一种全新的反向遗传学研究

方法。TILLING技术借助高通量的检测手段，

快速有效地从由化学诱变剂

（

EMS）诱变过的突变群体中鉴定

出点突变。

目前，

TILLING已被应用于多种生物的研究中。

本文系统介绍了

TILLING技术的基本原理、

技术

路线及其技术优势，

同时列举了

TILLING的应用实例，

并展望了

TILLING技术的应用前景。

关键词

TILLING,点突变,检测

IntroductiontotheTILLINGStrategy

WuHaibin1,2ZhuRucai2ZhaoDegang1*

1GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,GuizhouUniversity,Guiyang,550025

2HainanProvincialKeyLaboratoryofCropMolecularBreeding,Sanya,572025

*Correspondingauthor,degangzhao@

ABSTRACT

TILLING，TargetingInducedLocalLesionsINGenomes，Henikoff\'sResearch

GroupofFredHutchinsonCancerResearchCenterinSeattle,Washington,Gis唐诗三百首早教在线听 anovelreversege-

neticsstrategythatprovidesacompletelysolutionsforhighthroughputandlowcostdiscoveryofinducedpoint

lyTILLINGhasbeenappliedtolotofor-

ganismssuchasarabidopsis,tomato,maize,rice,soybean,lotus,nemetode,mouse,zebrafish,drosophilaetc.

ThispaperbrieflyintroducedtheTILLINGmethodologiesanditsadvantages,andalsolistedthe

Arabidopsis

TILLINGProjectasanapplicationcase.

KEYWORDS

TILLING,Pointmutations,Detection

TILLING，

即

TargetingInducedLocalLesions

INGenomes（定向诱导基因组局部突变技术）

，是由

美国

FredHutchinson癌症研究中心StevenHenikoff

领导的研究小组发展起来的，

是一种全新的反向遗

传学研究方法。主要的技术论文先后发表在Plant

Physiology、NatureBiotechnology、GenomeResearch

等学术刊物上。TILLING已成为自动化反向遗传学

解决方案的关键词，

以美国为首的北美实验室借助

高通量的

TILLING技术，启动了拟南芥TILLING

项目

（

Arabidopsis

TILLINGProject），获得美国国家

科学基金会植物基因组计划

（

PlantGenomeRe-

searchProgram，PGRP）大力资助，

在

ATP项目组内

部已经实现了材料、

DNA样品及突变信息的充分共

享，该项目在立项的第一年里就为拟南芥研究者们

提供了超过

100个基因上的1000多个突变位点。

国际上也有许多研究机构以TILLING作为技术平

台，展开了各自感兴趣的目标生物的功能基因组学

研究。

TILLING技术借助高通量的检测手段，

快速

有效地从由化学诱变剂

（

EMS）诱变过的突变群体

中鉴定出点突变。目前，TILLING已被应用于多种

生物的研究中。

本文系统介绍了

TILLING技术的基

本原理、技术路线及其技术优势，

同时列举了

TILL-

ING的应用实例，

并展望了

TILLING技术地应用前

景。

1TILLING技术路线

TILLING利用化学诱变方法

（

Chemicalmutage-

nesis）来产生一系列的点突变，

经过

PCR放大，PCR

片段变性退火，产生异源双链核酸分子

（

Heterodu-

plex），

再利用

CEL

I核酸酶处理后，

进行双色电泳分

析。

TILLING的具体操作步骤是

（图

1）：⑴EMS

（EthylMethaneSulfonicacid）处理种子，

诱导产生一

系列点突变；

⑵将种子培养，

获得第一代突变个体

（

M

1

）；⑶M

1

植株自花授粉，

产生第二代植株

（

M

2

）；

⑷M

2

植株抽提DNA存放于96孔微量滴定板，

并

保留M

2

代种子；⑸将多个96孔板的DNA样本合

并到一个96孔板内

（最多可合并

8个）得到DNA

池；⑹根据目标基因序列设计一对特异性引物进行

PCR扩增，两个引物分别用700nm和800nm荧光

染料标记；⑺PCR扩增片段变性、

退火，从而得到野

生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；⑻用特

异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源

双链核酸分子；

⑼酶切产物用变性的聚丙烯酰胺

（DPAGE）凝胶电泳分离，

然后用标准的图象处理程

序分析电泳图象，

获得突变池；

⑽利用相同方法从

突变池中筛选突变个体；⑾突变个体PCR片段测

序验证；⑿突变表型鉴定

（

Colbertetal.,2001;Tillet

al.,2003）。

图1植物中TILLING的技术路线(Colbertetal.,2001)

Figure1SchematicdepictingtheTILLINGstrategyappliedtoaplant(Colbertetal.,2001)

TILLING

技术的原理与方法述评

IntroductiontotheTILLINGStrategy

575

分子植物育种

MolecularPlantBreeding

最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突

变进行检测

（

McCallumetal.,2000a;2000b）。为了

进一步提高这个方法的效率，

适应大规模筛选的要

求，

Colbert等

（

2001）

对

TILLING作了改进。

他们将

所获

PCR片段先用特异性识别错配碱基的内切酶

酶切异源双链核酸分子，

再用变性的序列胶电泳分

离酶切产物，

用标准的图像处理程序分析点突变的

存在。有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识

别、切割，

包括

S1核酸酶

（

Howardetal.,1999）

和

T4

核酸内切酶Ⅶ（Youiletal.,1996）。目前，

使用较多

的是

S1核酸内切酶家族中的

CEL

I酶，它是一种从

芹菜

（

celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶

（Oleykowskietal.,1998）。

CEL

I酶能够识别错配碱

基并在错配碱基的3\'端进行切割，

再用变性的序列

胶

（

PAGE）分离酶切产物，

能够将超过

1kb的PCR

扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此，

改进的TILLING充分运用了

CEL

I酶和凝胶电泳技

术，从而使其成为一个低成本、

高通量的筛选突变

基因的技术平台。

1.1TILLING中的引物设计

根据目标基因序列设计引物，

是

TILLING中可

操作性较强的一个步骤，

引物设计的好坏直接影响

TILLING筛选的结果。为此，NickTaybr和Eliza-

(FredHutchinsonCancerResearch

Center,Seattle;http:

∥/coddle)为拟

南芥TILLING项目

（

Arabidopsis

TILLINGProject，

ATP）研究开发了CODDLE(CodonsOptimizedto

DiscoverDeleterious)程序。CODDLE能够识别各种

形式的序列信息，

并能根据输入的碱基序列产生基

因模型和蛋白质保守区域模型

（

Henikoffetal.,

2000）。CODDLE能够列出EMS诱导植株产生有害

突变的可能范围，

当

1000bp左右的区段被选中后，

系统就会根据最有可能突变成为高频率终止密码

子的区域或进化保守区域

（

McCallumetal.,2000b）

设计引物。

设计完成后，研究人员可以用

Primer3程

序

（

RozenandSkaletsky,2000）

对

CODDLE列出的

候选引物进行选择。

1.2TILLING中的点突变检测

通常点突变很难被检测，

一直是

TILLING应用

上的一个障碍。要得到好的结果，

要求检测仪器不

仅要灵敏度高，还要能够准确识别假阳性位点。

Collbert等

（

2001）将双色红外荧光扫描系统

（

Mid

dendorfetal.,1992）

引入

TILLING中，

大大提高了

筛选效率。由于杂质、

干扰分子在红外光区几乎不

发光，用红外荧光检测的背景非常低，

灵敏度高，能

够对由

8个DNA样品组成的DNA池中检测出

100attomoles的

CEL

I酶切产物。加上双通道检测

（

680nm激发，710nm检测；780nm激发，820nm检

测），两个通道检测波长相距110nm，几乎没有光谱

重叠的干扰，

保证

TILLING分析中每一个突变碱基

的准确识别及整个检测的灵敏度。在两个通道的电

泳图上的相同泳道都可以检测到新的条带。用

U-

NIX程序“grab”（http:∥）

可以

将

LI-COR扫描仪上的图像文件处理成适合于

AdobePhotoshop分析的JPEG压缩文件，

并进行存

档。图

2是一张典型的双色红外荧光检测电泳图

谱。由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记，

发生突变的泳道，

在

700nm的图上可以在野生型条

带下方看到一个条带，

同时在

800nm的图上的相同

的泳道也会有一个条带，这两个条带就是

CEL

I核

酸酶的剪切产物，

两个条带片段大小之和等于扩增

片段的大小，从而很容易对扩增产物进行突变检

测。近似的迁移距离可以通过对比Mr得出。Pho-

toshop图像处理工具能够容易的确定出发生突变的

泳道和突变带的迁移距离(Colbertetal.,2001)。

1.3TILLING中的突变体鉴定

一旦在一个DNA池中检测到了一个突变，

那

么就要对这个DNA池中每一个单株的DNA样品

进行筛选。单株的DNA样品可以排列在一个88

的微量滴定板中，每一个DNA池长安春望卢纶 对应一排(8个)

DNA样品。用一个有8个吸头的移液器将阳性

DNA池对应的8个DNA样品转移至一个新的微

量滴定板

（

812）中。因此每块板可以对12个阳性

的DNA池中的所有单株进行筛选。利用UNIX程

序

（

pick）可以方便的将要筛选的每一块96孔板的

每一行与阳性DNA池对应起来，并能以表格的形

式将结果输出。为了能够检测出突变，

每一个单株

的DNA样品中等量混入野生型DNA样品。

然后用

与筛选DNA池同样的方法筛选突变个体，包括

PCR扩增，

CEL

I酶切，

凝胶电泳，

Grab、Photoshop等

软件分析。筛选结果能将突变位点定位在几个碱基

对内。用这种两次筛选的方法，

筛选

1kb左右的目

标片段，

每块胶大约可以筛选

750kb的基因组序列

（1kb8个单株DNA96孔）。每个96孔DNA池

相当于768个单株，

平均可筛选到

7个点突变(Col-

576

bertetal.,2001)。

1.4TILLING中的突变表型鉴定

虽然TILLING大幅减少了发现突变的工作量，

但是后期确定突变表型需要做更多的工作。化学诱

变引入大量点突变，使得表型分析变得相对困难。

通常的做法是通过异型杂交，

产生多样性后代来确

定突变表型。然而一种快速方法是发现两个具有独

立有害突变位点的个体，

将二者杂交，

分析后代的

基因型。在每一个含有异等位基因的个体中，

都会

发现一个属于两个亲本之一的突变表型，

而将不互

补的背景突变独立归类

（

McCallumetal.,2000b）。

2TILLING技术优势

反义RNA技术

（

antisenseRNA）和插入突变技

术

（

insertionalmutagenesis）是植物中两种最常用的

反向遗传学研究方法。然而反义RNA抑制技术需

要花费相当大的精力来预先确定目标基因是否将

会表达；插入突变技术很难致使每个基因都发生插

入突变。当前

RNAi（RNAinterference）抑制基因表

达技术应用非常广泛

（

Waterhouseetal.,1998）。然

而RNAi的作用机理并不十分清楚，例如后代表型

图2双色红外荧光检测电泳图谱(Colbertetal.,2001)

注：

左边为

800nm电泳图，

右边为

700nm电泳图。在700nm电泳图上，用方框框出了四个突变条带，

并在最右边进行了放大。

Figure2AtypicalgelimageofIRDye800(left)andIRDye700(right)channels(Colbertetal.,2001)

Note:Bandscorrespondingtofourmutationsdetectedonthisgelareshownboxed,andsectionsoftheIRDye700imagesaremagni-

fiedinoffsets(farright)

的多样性和不可预知性

（

QueandJorgensen.,1998）。

同时，因为这些技术都要依赖于农杆菌T-DNA载

体进行转化或依赖于内源标签系统，

从而使这些技

术在反向遗传学的应用中受到极大限制

（

McCallum

etal.,2000b）。

TILLING不同于其它引起基因敲除突变的方

法，它利用化学诱变方法来获得所有基因的传统点

突变等位基因系列。对那些表型分析时会牵涉到亚

致死等位基因的重要基因，

TILLING的方法具有其

独特的优势。由于化学诱变剂能够对生物体诱导产

生高频率的点突变，

所以筛选所有目的基因只需要

相对较少的突变群体。

而且由于

TILLING利用传统

的化学诱登岳阳楼陈与义其一 变方法，

所以不需要耗时的转基因和复杂

的组织培养。从而使

TILLING成为一种高通量、

低

成本、高效率的反向遗传学研究方法。

2.1TILLING能够预测突变概率

TILLING技术的优点之一是有害突变的概率

能够预先计算出来。目前使用较多的诱出淤泥而不染濯清涟而不妖全诗 变剂是

EMS。EMS是一个稳定、

高效的烷基化诱变剂，

已被

广泛用于农作物的诱变育种。

EMS主要诱发点突

变，可能导致三种突变类型。第一种，

诱导密码子变

TILLING技术的原理与方法述评

IntroductiontotheTILLINGStrategy

577

分子植物育种

MolecularPlantBreeding

为终止密码子，使翻译出的蛋白质失去原有功能，

导致无义突变

（

nonsensemutations）；第二种，

诱导突

变发生在编码区以外或发生在编码区内，

但不改变

氨基酸编码顺序，导致沉默突变

（

silencemuta-

tions）；第三种，诱导突变引起氨基酸编码顺序的改

变，被称为错义突变

（

missensemutations）。

估计三种

突变的比例对构建突变群体和

TILLING后期确定

突变位点具有很大的指导意义。EMS主要诱导碱基

从C到T的改变，从而导致碱基对从C/G到T/A

的转换突变。根据各种作物的氨基酸编码习惯，

就

可以大概预计出发生三种突变的比例。例如，

在拟

南芥中，

可知大约

5%的突变是无义突变，35％是沉

默突变，65％是错义突变

（

McCallunetal.,2000a）。

2.2TILLING能够有效排除假阳性

TILLING技术的优点之二是采用双色红外荧

光检测

CEL

I酶切产物，

能够有效排除假阳性条带。

假阳性通常有两种情况，

一种是在一个通道的电泳

图中多个泳道出现阳性条带；

另一种情况是在两个

电泳图的相同泳道的相同位置出现阳性条带。因为

在两个不同植株中出现相同的点突变的可能性很

低，推测发生第一种情况可能是由于某种同源双链

对

CEL

I酶特别敏感，

能够被其酶切，从而使得同样

条带出现在一张电泳图的不同泳道上。而发生第二

种情况可能是由于错误的引发导致产生大量的相

同大小的双末端标记产物，

在扩增循环中，

小的产

物比大的产物有一定的选择优势。Colbert等研究发

现，当一对引物分别用700nm和800nm荧光染料

标记时，PCR产物的产量会比较低并且不稳定；

但

是当把有标记的引物和没用标记的引物混和后进

行扩增，

PCR产物就会相当稳定

（

Colbertetal.,200

1）。

2.3TILLING技术可自动化操作

TILLING技术集成了高通量的电泳检测设备，

优秀的图像处理系统和分析软件及一种能够给96

孔微量滴定板自动加样的设备

（

Underhilletal.,

1997），容易地实现了自动化操作。目前在拟南芥中

TILLING已能够完全自动化

（

Tilletal.,2003）。

TILLING是一种高通量并且相对廉价的技术，

它不需要先进的仪器设备就能够实现对突变体库

的大规模筛选。筛选每块

96孔微量滴定板相当于

筛选了768个M

2

单株

（

896），每个目标筛选区段

大约为1000bp，那么每块胶大约可以检测750kb的

基因组序列。Colbert等

（

2001）的实验中，

仅需要一

个技术员，一天就能完成四轮筛选工作，可以对

3000个突变株进行检测，

相当于检测了三百万个碱

基对。对于有着高突变频率的群体，

一天就可以筛

选出

20个突变，至少可以鉴定出一个基因。

2.4TILLING技术适用于大量或小量筛选

TILLING技术在适应于大量筛选的同时，

也适

合于少量筛选，

因为高密度的点突变需要相对少的

突变群体。在拟南芥中，

高通量的

TILLING筛选基

因只需要原来一半数目的突变群体，Till等的试验

中,只需要6912个拟南芥突变单株，

就能够用一对

引物筛选出期望的突变基因(Tilletal.,2003)。

如果

使用多对引物筛选一个基因，

那就需要更少的突变

单株，

McCa便胜却人间无数什么意思 llum等(2000b)报导，1000个突变株即

可达到要求。

3TILLING技术的应用实例

目前，TILLING作为一种全新的反向遗传学研

究方法已经应用于多种生物中，如拟南芥

（

Ara原

bidopsis

）、

玉米（

maize）、

水稻（

rice）、

百脉根

(

Lotus

japonicus

)、小鼠

（

mouse）、斑马鱼

（

Zebrafish）、

果蝇

（Drosophila）、

线虫

（

s

）等。对于拟南芥，

这

一技术已经非常成熟，并能够实现流水线操作，

大

量的突变序列都可以应用

insilico

进行分析。

近年来，美国国家科学基金会植物基因组计划

（

PlantGenomeResearchProgram，PGRP）大力应用

高通量TILLING技术，并直接推动了以美国为首的

北美实验室联合启动拟南芥TILLING项目

（

Ara原

bidopsis

TILLINGProject）。该项目在立项的第一年

里就为拟南芥研究者们提供了超过100个基因上

的1000多个突变位点。

在ATP项目组内部已经实现了材料、DNA样

品及突变信息的充分共享。ATP的TILLING由四

步组成

（图

3）。第一步，

研究人员根据感兴趣的基

因，设计合适的引物。研究人员可以在网上通过自

动的“

Frontend”系统进行设计，

利用

“

Frontend”

系

统中的

CODDLE程序

（

/coddle），

可

以得到基因模型和保守的蛋白质模型，

并能够进行

引物设计。

目前

“

Frontend”系统非常完备，TILLING

中超过90%引物都是通过这一系统设计的。

研究人

员收到引物以后，第二步筛选由八个

DNA样品组

成的DNA池。第三步是对阳性DNA池进行突变个

578

体筛选及突变个体PCR片段的测序验证。第四步，

研究人员可以进入一个

ATP项目组的公用突变信

息数据库，

（

/parsesnp/），利

用

BLASTN和BLASTP程序对所得到的突变序列进

行分析。

同时，研究人员在

PARSEANP（www.

/parsesnp/）程序的帮助下可以分析出突

变的性质。最后，

研究人员根据筛选得到的突变植

株编号，可以在拟南芥生物资源中心的种子库中得

到相应突变株的种子，

从而再进行表型鉴定。

Fredhutchinson癌症研究中心的Till等

（

2003）

利用6台能够自动加样的LI-COR凝胶分析系统，

每8h进行两轮筛选，从而可以达到对大约10000

株拟南芥进行检测，

每天筛选

3个基因的水平。

4展望

反向遗传学是相对于正向遗传学

（

forwardge-

netics）来说的，在已知基因序列的基础上研究基因

的生物学功能。随着各种生物基因序列库的扩充，

反向遗传学方法将逐渐取代表型筛选

（正向遗传学

方法）成为功能基因组学研究的主要方法。传统的

反向遗传学方法

，如用转座子

（

transposon）

或

图3拟南芥TILLING项目

（

ATP）主要步骤(Tilletal.,2003)

Figure3Outlineofstepsinvolvedinthe

Arabidopsis

TILLINGProject.(Tilletal.,2003)

T-DNA敲除特定基因，虽然可以准确测定表型，

但

需要进行耗时的转基因和复杂的组织培养，

而且这

些方法是将整个基因敲除

,无法观察到活性基因功

能部分缺失的结果。利用点突变可以精确鉴定基因

的功能

,在基因功能鉴定上有着独特的优势，但由

于点突变不易鉴定，

在功能基因组学上的应用受到

限制。美国

FredHutchinson癌症研究中心Steven

Henikoff领导的研究小组发展起来的TILLING技

术借助高通量的检测手段，

快速有效地从由化学诱

变剂

（

EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。有

效地解决了这一问题。

TILLING作为一种高通量，

低成本的反向遗传

学研究方法，并不需要先进的生物学仪器设备，

基

因组序列信息就是其工作的弹药

(McCallumet悬灯结彩的意思 al.,

2000b)。随着越来越多生物全基因组测序的完成，

我

们有理由相信TILLING技术将会得到更加广泛的

应用。

致谢

作者感谢海南省热带农业资源开发利用研究

所所长方宣钧博士阅读本文初稿并提出宝贵的修

TILLING技术的原理与方法述评

IntroductiontotheTILLINGStrategy

579

分子植物育种

MolecularPlantBreeding

改意见。本工冯延巳醉花间全诗及译文 作由海南省农作物分子育种重点实验

室开放基金及贵州

“十五”攻关项目“水稻抗冷害基

因工程育种研究”

黔科合

（

2002）1134资助。

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